Polymeraasiketjureaktio

Polymeraasiketjureaktiossa (PCR/Polymerase chain reaction) yksittäinen geeni tai pätkä DNA:ta voidaan monistaa. Se tehdään elävien solujen ulkopuolella laboratoriossa käyttämällä erityistä PCR-laitetta. Laitteen avulla todella pienestä määrästä DNA:ta saadaan muutamassa tunnissa monistettua miljardikertainen määrä, jolloin materiaalia on riittävästi tarkempia tutkimuksia varten. PCR on nykypäivänä tärkeä ja tarpeellinen osa laboratorion arkea. Sille keksitään jatkuvasti uusia sovelluksia. Sen avulla tehdään esim. perinnöllisten sairauksien etsimistä, infektiosairauksien diagnosointia, yksilöiden tunnistusta sormenjäljestä ja geenien kloonausta. 

PCR:ssä on kolme vaihetta. Ensimmäinen niistä on; Denaturaatiovaihe. Siinä tutkittava seos kuumennetaan 94-98°C:een 30-60 sekunniksi. DNA denaturoituu ja korkean lämpötilan vuoksi vastinjuosteet irtoavat toisistaan.

Toinen vaihe on nimeltään Alukkeiden liittymisvaihe. PCR-menetelmässä tarvitaan myös korkeaa lämpötilaa kestävää DNA-polymeraasientsyymiä, jota on eristetty kuumien lähteiden bakteereista sekä alukkeita, jotka mahdollistavat DNA-polymeraasin toiminnan ja joiden avulla rajataan monistettava DNA-jakso. Alukkeet ovat lyhyitä, yksijuosteisia DNA-pätkiä, joiden emäsjärjestys vastaa tiettyä kohtaa monistettavasta DNA-jaksosta. Tässä vaiheessa lämpötila lasketaan 45-65 °C:een riippuen edellä mainituista aineista. Liittymisvaiheessa tutkittavalle DNA-kohdalle kiinnittyvät erityiset alukkeet molempiin DNA:n vastinjuosteisiin erikseen. Se tapahtuu emäsparisäännön mukaan.

Tätä seuraa kolmas vaihe eli Pidentymisvaihe. DNA-polymeraasi aloittaa vastinjuosteen luomisen erillisille DNA:n vastinjuosteille. Lämpötila on useimmiten 72 astetta. Vaiheen kesto riippuu halutun monistuksen pituudesta ja kompleksisuudesta.

Näitä vaiheita toistetaan useasti, siihen asti kun haluttua ainesta on tarpeeksi. DNA:n määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä, joten jo 28 syklin jälkeen alkuperäisestä DNA molekyylistä on tuotettu noin 270 miljoonaa kopiota.

Viimeisen syklin jälkeen suoritetaan vielä loppuekstensio, jonka tehtävänä on varmistaa, että polymeraasientsyymi on rakentanut kaikki aloitetut DNA-monistukset loppuun saakka.

Jenni